摘要：目的对制何首乌5种主要药效/毒效成分没食子酸、大黄素、二苯乙烯苷、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷进行生物药剂学分类系统（BCS）研究。方法分别采用平衡溶解度法和外翻肠囊法研究各代表成分的溶解度和渗透性，采用2种软件PipelinePilot7.5和ChemDraw7.0预测各成分的溶解性和渗透性参数，采用美国食品药物管理局（FDA）标准分别对代表成分实测值与预测值进行经典BCS分类研究，同时评估其相关性。结果初步判定制何首乌中大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素甲醚为BCSIV类药物；二苯乙烯苷和没食子酸属于BCSIII类成分，渗透性是其吸收过程中主要限制因素。蒽醌类化合物的BCS分类研究存在差异，软件预测存在假阳性。结论采用体外生物利用度快速评价方法对制何首乌中5种主要药效/毒效成分进行BCS分类研究，为中药体内吸收预测和体外安全性评价提供研究思路和实验范例。
生物药剂学分类系统（BCS）是依据药物的体外溶解性和肠道渗透性的高低，将药物分成4大类[1]：第I类为高溶解度-高渗透性药物，其溶解性和渗透性不会限制体内吸收；第II类为低溶解度-高渗透性药物，药物渗透性不会限制体内吸收；第III类为高溶解度-低渗透性药物，此类药物的体内吸收几乎不受剂型因素影响，其跨过小肠上皮细胞的能力是其吸收的限速步骤；第IV类为低溶解度-低渗透性药物，这类药物溶解性和透过性均会限制吸收，成药性差。目前，BCS分类系统已成为近年来新药开发和监督管理强有力的工具之一[2-4]。不仅用于新药研发阶段候选药物的筛选或进行合理的剂型设计，还可用于预测药物体内外相关性。
制何首乌PolygoniMultifloriRadixPraeparata始载于《开宝本草》，为蓼科何首乌属植物何首乌PolygonummultiflorumThunb.的干燥块根的炮制品，具有补肝肾、益精血、乌须发、化浊调脂等功效[5]。中药所含成分复杂，逐一进行体内过程筛选存在较大的困难，BCS为其提供了一种体外生物利用度评价方法，将大量实验简化为二维参数，主要从影响药物吸收的2个重要参数溶解度和渗透性对药物进行分类，从而对活性或毒性成分进行体外生物利用度评价[4,6-7]，但目前在中药领域的应用较少。本研究基于前期研究结果选择具有肝细胞毒性的没食子酸和大黄素[8-10]，主要活性成分二苯乙烯苷，不同极性的无肝细胞毒性的大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为模型药物[11]，对制何首乌中5种主要药效/毒效成分进行BCS分类研究，为制何首乌所含活性成分的生物药剂学分类研究提供数据支持。
1仪器与材料
1.1材料及试剂
二苯乙烯苷（批号W13-3-6）、没食子酸（批号W00-5-4）、大黄素（批号W00-1-5）、大黄素甲醚（批号W05-1-6）、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（批号W17-9-5）对照品均购自天津中新药业股份有限公司，质量分数均＞98%；氯化钠、氯化钾、氯化镁、氯化钙、碳酸氢钠、葡萄糖、磷酸二氢钠、磷酸二氢钾、乙腈（色谱级）购自美国SigmaAldrich公司；盐酸购自天津市科密欧化学试剂有限公司；甲酸（色谱级）购自天津市大茂化学试剂厂。
1.2仪器
Hclass超高效液相色谱仪，美国Waters公司；Milli-Q超纯水仪，美国Millipore公司；H-W离心机，长沙湘仪离心机仪器有限公司；TK-20B型透皮扩散仪，上海锴凯科技贸易有限公司；BPS十万分之一天平，德国Sartorius公司；SB-D数控超声波清洗器，宁波新芝生物科技股份有限公司。
1.3实验动物
健康雄性大鼠，品系SD（Spraque-Dawley），级别普通，体质量（±10）g，由中国军事科学院提供，许可证号SCXK-（军）-，动物伦理审查批准号TJAB-TJU。
2方法
2.1对照品溶液的制备
分别精密称取二苯乙烯苷4.34mg、没食子酸4.90mg于10mL量瓶中，称取大黄素1.52mg、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷2.35mg、大黄素甲醚1.50mg于25mL量瓶中，甲醇定容即得对照品储备液。
2.2色谱条件
WatersBEHRPC18色谱柱（mm×2.1mm，1.7μm）；流动相为乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）；采用等度洗脱[11-12]：二苯乙烯苷（15%A∶85%B，nm）；没食子酸（10%A∶90%B，nm）；大黄素（55%A∶45%B，nm）；大黄素甲醚（60%A∶40%B，nm）；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷（30%A∶70%B，nm）；体积流量0.2mL/min；柱温35℃；进样量5μL。
精密度、重复性、稳定性试验中没食子酸、大黄素、二苯乙烯苷、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的保留时间RSD＜2%、峰面积RSD＜3%，均符合要求，表明精密度、重复性良好，样品溶液在24h内稳定。5种成分的平均加样回收率分别为99.8%、.2%、.2%、98.7%、96.9%（n＝6），均符合方法学考察要求。
没食子酸、大黄素、二苯乙烯苷、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的线性回归方程分别为Y＝X＋，r＝0.；Y＝X＋，r＝0.；Y＝.5X＋.4，r＝0.；Y＝.6X＋.1，r＝0.；Y＝.57X＋.12，r＝0.；结果表明没食子酸、大黄素、二苯乙烯苷、大黄素甲醚和大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷分别在10～50mg/mL、0.05～20μg/mL、10～mg/mL、1～40μg/mL、0.22～6.94μg/mL线性关系良好。
2.3溶液配制
2.3.1Krebs-Ringer’s肠营养液的配制称取NaCl8.00g、KCl0.20g、MgSO40.26g、NaH2PO40.g、NaHCO31.00g加水溶解，临用前分别加入CaCl20.20g和葡萄糖1.00g，边搅拌边加入超纯水定容至1L。
2.3.2渗透性样品溶液的配制精密称取二苯乙烯苷、没食子酸、大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷、大黄素甲醚对照品适量，加K-R液溶解并定容至mL，即得二苯乙烯苷52.0μg/mL、没食子酸52.7μg/mL、大黄素24.0μg/mL、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷18.4μg/mL、大黄素甲醚22.7μg/mL的供试品溶液。
2.4制何首乌主要成分的平衡溶解度研究
依据FDA标准方法进行平衡溶解度[13]的测定，取过量的各成分于mL超纯水中，在37℃水浴中、60r/min下磁力搅拌平衡24h，使各成分在超纯水（pH7.0）中饱和，取μL饱和溶液于10r/min离心5min，超纯水稀释后，UPLC分析，实验平行3组进行以保证结果的准确性。
2.5制何首乌主要成分的透过性研究
实验依据文献方法并在实验室适宜的条件下进行[14]。大鼠实验前禁食12h，自由饮水，麻醉后沿腹白线剖开腹部，迅速取出10cm左右肠段立即放入氧气饱和的冷的Krebs-Ringer’s肠营养液中清洗，除去浆膜层外面的脂肪组织，用玻璃棒将肠道翻转使黏膜面朝外，洗净内容物，切去两端各1cm，一端结扎，另一端系于剪去底部的内衬管上，向肠囊内注入空白Krebs-Ringer’s液。平衡5min，将肠囊置于37℃恒温并盛有mL一定质量浓度的各药液的烧杯中，恒流泵通空气。分别于15、30、60、90、min取样0.2mL，同时补充等体积、新鲜且37℃恒温的空白Krebs-Ringer’s肠营养液，取样后测量各肠段的长度和内径，计算肠囊的表面积。样品在10r/min下离心5min，取上清液UPLC进样分析，实验平行3组进行以保证结果的准确性。
3结果
3.1制何首乌各成分在超纯水中的溶解度
根据经典BCS理论，参考FDA对BCS溶解性的标准评判药物溶解度高低：在37℃，pH值在1～6.8时，剂量数（D0）≤1，为高溶解性，反之则为低溶解性。D0是反映药物溶解性与口服吸收关系的参数，体现了药物的溶解性能。
通过计算，二苯乙烯苷、没食子酸、大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在水中的平衡溶解度（Cs）分别为.00、20.00、0.12、4.54μg/mL（n＝3）。其次，依据公式D0＝D/(V0Cs)计算D0（其中D为药物的剂量，制何首乌的每日最大剂量为12g，结合《中国药典》以及相关文献报道[15-18]，按照制何首乌的每日最大口服剂量确定二苯乙烯苷、没食子酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷的每日最大剂量分别为84.0、18.52、6.00、6.00、34.32mg；V0为溶解药物所需的体液体积，按照典型生物等效性实验协议规定[1]为mL；Cs为药物的溶解度）。
根据上式计算得到制何首乌各代表性成分二苯乙烯苷、没食子酸、大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷在超纯水介质中的D0分别为4.39×10?3、6.16×10?3、、＞24、30.24。结果显示二苯乙烯苷、没食子酸为高溶解性成分，大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为低溶解性成分，而大黄素甲醚在超纯水介质中基本无法检测到，也属于低溶解性成分。
3.2制何首乌中主要成分的渗透性研究
制何首乌中二苯乙烯苷和没食子酸在各时间点的单位肠管面积累积吸收量（Qn）见图1，分别计算取样终点时（min）不同药物在肠中的累积吸收量（Qz）、渗透系数（Papp）以及吸收率（P），考察药物对肠吸收的影响，结果见表1。
Ci为各取样点质量浓度，V为肠段体积，Vi为取样体积，A为肠段表面积，t为取样终点时间，C为样品初始质量浓度
二苯乙烯苷和没食子酸在不同肠段的累积吸收存在一定差异，二苯乙烯苷在十二指肠的吸收最好，而没食子酸在空肠段的吸收最好。
渗透性高低的评判标准以外翻肠囊法得到的美托洛尔Papp值为判断标准，Papp≥8.4×10?5cm/s为高渗透性物质，反之则为低渗透性物质，由此可知本实验中二苯乙烯苷和没食子酸均为低渗透性物质，大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷无法透过肠壁，也为低渗透性物质。
3.3制何首乌主要药效/毒效成分的经典生物药学分类研究
3.3.1基于实验方法的制何首乌代表成分经典BCS分类依据经典BCS分类标准[19]对制何首乌中代表成分进行BCS分类，结果如图2。其中，二苯乙烯苷（THSG）和没食子酸均为BCSIII类药，大黄素、大黄素甲醚、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷均为BCSIV类药。
3.3.2基于软件模拟计算制何首乌中代表成分经典BCS分类研究采用PipelinePilot7.5[20]预测制何首乌主要药效毒效成分在25℃水中的溶解度（lgS）及AlgP值，并结合制何首乌各代表成分的服药量推算出D0。采用ChemDraw7.0[21]预测得到各代表成分的油水分配系数（lgP），具体结果见表2。根据预测结果对制何首乌中5种代表性成分进行BCS分类。以美托洛尔为参比物质，lgP≥1.为高渗透性药物，反之则为低渗透性药物。依据经典BCS分类标准[19]对制何首乌代表成分进行BCS分类。基于软件预测值D0-lgP的制何首乌代表成分经典BCS分类结果（图3）与基于D0-AlgP的经典BCS分类结果相同，二苯乙烯苷（THSG）、没食子酸与大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为BCSIII类药，而大黄素、大黄素甲醚为BCSI类药。
3.3.3软件预测值假阳性与假阴性结果排查以预测D0值为横坐标，实测D0值为纵坐标，对软件预测得到的溶解性参数D0进行假阳性、假阴性结果排查。以溶解性高低临界值1为标准，坐标轴相交在点（1，1）处，以此确定坐标象限图，如图4，可知软件预测的大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷和大黄素甲醚的D0值为假阳性结果。
以外翻肠囊法得到的制何首乌各代表成分的渗透系数Papp为准，对软件预测得到的渗透性参数lgP假阳性、假阴性结果进行排查，如图5可知，大黄素和大黄素甲醚的lgP值为假阳性结果。
4讨论
本研究在前期研究基础上利用实验方法及两种软件模型对制何首乌中主要药效/毒效成分进行生物药剂学分类研究，对口服中药制何首乌的多种成分进行生物利用度的体外评价。在考察BCS方法对中药活性成分适用性的同时，评估实验方法与软件预测方法对制何首乌各代表成分BCS分类结果的相关性。
实验方法BCS分类结果初步判定制何首乌中大黄素、大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷及大黄素甲醚为BCSIV类药物，根据软件预测值及分类标准大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷被分为BCSIII类药物，而大黄素和大黄素甲醚为BCSI类药物，蒽醌类成分BCS分类研究中实验方法和软件预测结果存在差异。研究发现实际中，大黄素和大黄素甲醚为多羟基的蒽醌类化合物，具有一定的酸性，在pH7.0超纯水介质中难以成盐，溶解性不好，故为低溶解性药物，与文献报道基本一致[22]，而在软件模拟中预测为易溶性导致分类结果出现假阳性。文献报道的大黄素透过性实验多采用饱和甲醇溶液稀释而成，且加入N,N-二甲基甲酰胺来增加其溶解度，故渗透性较好[23-24]；大黄素-8-O-β-D-葡萄糖苷为含蒽醌类结构的大分子化合物，在软件模拟计算中作为糖苷类成分，溶解性预测结果较好，与实验结果存在较大差异[25]，说明现有的BCS预测方法对蒽醌类成分并不完全适用，有待进一步改进。
制何首乌主要药效成分二苯乙烯苷为多羟基酚类化合物，高浓度下具有体外肝细胞毒性的没食子酸为有机酸，二者水溶性均良好，属于高溶解性物质，其实验值与软件预测结果一致，均为BCSIII类药物，透过性是药物吸收过程中主要的限制因素，考虑到药物实际的使用和调剂过程，BCSIII类药物在符合快速溶出条件下，极有可能经口服吸收进入体内，经肝脏代谢累积发挥药效或毒效作用。本研究所开发的方法对制何首乌中多种活性或肝细胞毒性成分的体外生物利用度与体内吸收做出初步预测，可以为中药有效成分成药性评价及安全性体外评价提供新的思路与技术支持。
参考文献（略）
来源：曹雪晓，任晓亮，王萌，孙立丽，邓雁如．制何首乌中主要药效/毒效成分的生物药剂学分类系统评价研究[J].中草药,,51(13):-.
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